Modèle d`exemplaire unique

La dégénérescence des processus neuronaux a déjà été rapportée dans un modèle de souris à une seule copie ALS SOD1 et dans d`autres modèles de C. elegans de maladie neurodégénérative [20, 37]. Dans la tête et la queue, C. elegans ont des processus neuraux sensoriels glutamatergiques qui sont exposés à l`environnement, ce qui permet l`absorption de colorants fluorescents lipophiles, tels que DiD (C67H103ClN2O3S). La perte de processus sensoriel dégénérative ou la mort cellulaire arrête complètement l`absorption des colorants par les neurones individuels, comme le montrent les modèles C. elegans de la toxicité de la polyglutamine de la maladie de Huntington [37]. Sans stress oxydatif induit par le paraquat, l`absorption de colorant était normale chez tous les animaux modèles de C. elegans ALS SOD-1 et chez les animaux dépourvus de fonction SOD-1 (plus de 30 animaux marqués par génotype, plus de deux essais). Les neurones ASH, PHA et PHB n`ont pas pris de DiD chez les animaux SOD-1 (-) après le stress oxydatif induit par le paraquat (Fig 5D et 5G), mais l`absorption a été normale dans cinq autres classes de neurones glutamatergiques. Les animaux à simple copie/knock-in SOD-1H71YM, SOD-1G85RM, SOD-1G85RC et SOD-1L84VC avaient une absorption de colorant défectueuse dans les mêmes neurones après une exposition au stress oxydatif, bien que la pénétration de ce défaut variait entre les génotypes avec peu de dégénérescence dans SOD-1L84VC (Fig 5C, 5D et 5G). Encore une fois, cinq autres classes de neurones glutamatergiques qui prennent DiD n`ont pas été affectées dans tous ces génotypes. Aucun défaut d`absorption de colorant n`a été observé chez les animaux SOD-1A4VM et SOD-1G93AC, même après le traitement par paraquat (Fig 5D et 5G). Les gènes nucléaires à copie unique améliorent la résolution phylogénétique dans les Brassicaceae.

On a trouvé un seul arbre le plus parcimonieux à partir de l`analyse combinée de la matrice de données complète contenant les gènes g32520, g13360 et AT5 g23290 (L = 961, indice de cohérence = 0,774, indice de rétention = 0,529). Les valeurs bootstrap sont affichées au-dessus des branches. Notez que les arborescences de gènes individuelles ont donné des topologies similaires. La phylogénie est cohérente avec les phylogénies publiées en utilisant plus de taxons et d`autres marqueurs moléculaires. Les valeurs bootstrap de Beilstein et coll., 2006 sont affichées sous les branches. De plus, à l`aide de la recombinaison homologue (HR) à médiation CRISPR/Cas9, nous avons directement édité le gène endogène de la SOD-1 de C. elegans pour recréer les mutations de l`ALS SOD1 pour les L84V, les G85R et les G93A dans le gène de la SOD-1 endogène sur le chromosome II (Fig 1C). L`édition du génome à médiation CRISPR/Cas9 nécessite l`introduction de changements de codons silencieux dans le SOD-1 endogène. Par conséquent, un contrôle de type sauvage a été généré contenant des mutations silencieuses identiques (Fig. 1C).

Les modèles générés par crispr/Cas9 ont été nommés avec un exposant «C» (SOD-1wtc, SOD-1l84vc, SOD-1g85rc et SOD-1g93ac). Pour démontrer la reproductibilité entre les souches générées par MosSCI et CRISPR/Cas9, nous avons créé l`allèle G85R deux fois, une fois à l`aide de chaque technique (Fig. 1B et 1C). (A et B) Pour évaluer la durée de vie dans les modèles de knock-in de C. elegans, nous avons marqué la survie à 25 oC en alternance de jours avant l`âge adulte (stade L4) jusqu`à la mort. La durée de vie des Monocopies SOD-1G85RM (Panel A) et SOD-1G85RC (Panel B) ne différait pas de celles des contrôles de type Wild appropriés (SOD-1G85RM vs SOD-1WTM, P = 0,64; SOD-1G85RC vs SOD-1WTC, P = 0,32). Les animaux à simple copie/knock-in SOD-1A4VM, SOD-1H71YM, SOD-1L84VC et SOD-1G93AC, ainsi que les animaux dépourvus de contrôles endogènes SOD-1 ou emptyM, ont montré une légère diminution de la durée de vie, comparativement à leurs contrôles de type sauvage respectifs. La plus grande différence de durée de vie médiane a été observée chez les animaux SOD-1H17YM; la durée de vie médiane a diminué de 14 à 9 jours.

SOD-1L84VC indiqué avec #. SOD-1 (+) est une souche N2 standard. La survie a été notée en l`absence de FUDR dans des conditions de culture standard, déplaçant les animaux vers de nouvelles plaques tous les deux jours pour éviter la contamination de la progéniture. Les animaux qui ont quitté la plaque ou les animaux avec l`éclosion interne d`oeufs ont été censurés; ces animaux ont été inclus dans les déterminations de la durée de vie jusqu`au jour précédant la censure.

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